http://dspace.utalca.cl/handle/1950/100 Search the Channel search http://dspace.utalca.cl/simple-search http://dspace.utalca.cl/handle/1950/8688 Title: Caracterización de genes que codifican para transportadores de boro expresados diferencialmente durante el desarrollo reproductivo de Vitis vinífera L. ev. Carménere<br/><br/>Authors: Pérez Castro, Ramón Andrés; González Villanueva, Enrique (Prof. Guía); Ruiz Lara, Simón (Prof. Guía)<br/><br/>Abstract: Vitis vinifera L. cv Carménère comúnmente presenta una anomalía durante el desarrollo reproductivo denominada “millerandage” que se traduce en la presencia de bayas semilladas y no semilladas (partenocárpicas) de tamaño diferencial en un mismo racimo. Tal evento ha sido asociado, entre otros factores, a la deficiencia de boro (B). Este micronutriente es esencial en vegetales ya que forma parte del complejo RG-II-B, entrecruzando dos cadenas ramnogalacturonano II, componente de las pectinas de la pared celular, siendo este complejo fundamental para el desarrollo de estructuras reproductivas tales como polen y tubo polínico. En condiciones deficientes de B, este micronutriente es captado desde la rizósfera mediante el canal NIP5;1 y posteriormente cargado al xilema mediante el transportador BOR1. Estudios preliminares tendientes a dilucidar genes que estuviesen relacionados con el “millerandage”, determinaron la expresión diferencial entre bayas semilladas y no semilladas de una secuencia parcial homóloga a BOR1 de Arabidopsis thaliana. El objetivo de esta tesis fue aislar y caracterizar genes de vid codificantes para NIP5;1 y BOR1 y relacionar su expresión con la acumulación de B, el desarrollo reproductivo, y el fenotipo de las bayas. Ambos genes fueron aislados desde tejido floral, corroborándose su identidad por secuenciación. Mediante fusión a GFP y posterior expresión en A. thaliana, se determinó que VvBOR1 es una proteína de membrana localizada en el dominio proximal de la membrana plasmática en células de las raíces. A través de la expresión heteróloga de VvBOR1 en levaduras y A. thaliana mutantes para sus transportadores endógenos, se determinó que VvBOR1 es un transportador de eflujo de B con una una tasa menor de transporte en comparación a su homóloga de A. thaliana. Finalmente, mediante analisis de qRT-PCR en tiempo real se determinó que el gen VvBOR1 presenta patrones de expresión similar en cv. Cabernet Sauvignon y Carménère, mientras que el gen VvNIP5;1 exhibe patrones de expresión disímiles en esas mismas variedades. Sin embargo, ambos genes se expresan en menor medida en bayas partenocárpicas de Carménère, demostrándose una relación entre estado de desarrollo, fenotipo de la baya y expresión de estos genes. Adicionalmente, VvBOR1 presentó una correlación entre su expresión y la acumulación de B en bayas. Estos resultados sugieren una relación entre la expresión de estos genes y el desarrollo reproductivo normal del cultivar Carménère./ABSTRACT: Vitis vinifera L. cv Carménère usually express impairments during its reproductive development, commonly called “millerandage”. This failure triggers the formation of both normal size and small-size seedless grapes in the same bunch. Among other factors, boron deficiency has been associated to this phenomenon. This micronutrient is essential in plants because of its role in cross-linking two rhamnogalacturonan-II (RG-II) chains in the conformation of the RG-II-B complex, a key component of cell wall pectins. This polysaccharide is required for development of reproductive structures such as the pollen tube. Under B deficiency, channel NIP5;1 uptakes B from rhizosphere and then it is loaded to xylem by BOR1 transporter. Preliminary research to find millerandage-related genes, showed that a EST sequence, homologue to the AtBOR1 gene from A. thaliana thaliana, was differentially expressed between normal size and small-size seedless grapes. The main aim of this study was to isolate and to characterize grapevine genes encoding for NIP5;1 y BOR1 transporters and to associate their expression to B content, reproductive development, and grape phenotype in the cultivar Carménère. Both genes were isolated from floral tissues and their sequence identity was confirmed. The expression in A. thaliana of the hybrid protein VvBOR1-GFP, shows that VvBOR1 is membrane protein with a polar localization to the proximal domain of plasma membrane of root cells. Heterologous expression of the VvBOR1 gene in a yeast mutant strain and a A. thaliana mutant line, both deficient for boron transport, showed that VvBOR1 is an efflux B transporter, with a low efficiency when compared to its homologue from A. thaliana, AtBOR1. Finally, real time qRT-PCR analysis indicates that while VvBOR1 gene shows similar expression profiles in Cabernet Sauvignon and Carménère, VvNIP5;1 gene shows a cultivar-dependent expression pattern. Nevertheless, both genes appear to be repressed in parthenocarpic grapes. Futhermore, a correlation between VvBOR1 expression and boron content in grapes has been determined. All together, these results suggest a correlation between gene expression and normal reproductive development in cv. Carménère.<br/><br/>Description: 101 p. http://dspace.utalca.cl/handle/1950/8687 Title: Control de la polilla del tomate (tuta absoluta, M) utilizando el sinergismo entre una quitinasa y una &- endotoxina nativa de Bacillus thuringiensis<br/><br/>Authors: Niedmann Lolas, María Lorena; Meza Basso, Luis (Prof. Guía); Casaretto Vargas, José (Prof. Guía)<br/><br/>Abstract: En la actualidad existe preocupación por el uso indiscriminado de pesticidas en la agricultura. En respuesta a esta situación, en los últimos años, se ha estimulado eluso de “biopesticidas” considerando que a diferencia de los pesticidas químicos, sonseguros desde el punto de vista ambiental e inocuos para el resto de los seres vivos.Comúnmente, los biopesticidas son agentes de control biológico generalmente de origenmicrobiano (hongos y bacterias). El mayor número de especies conocidas conpropiedades bio-insecticidas pertenece al género Bacillus, en particular a la especieBacillus thuringiensis (Bt). Algunos aislados de Bt probados en estudios previospresentaron actividades insecticidas significativas contra la larva de la polilla del tomate(Tuta absoluta). Sin embargo, los resultados no fueron totalmente satisfactorios debidoprincipalmente, al hábito alimenticio de esta plaga. La alternativa que se plantea en elpresente trabajo para soslayar este problema fue la generación de plantas transgénicasque expresan un gen seleccionado de una de las δ-endotoxinas activa contra larvas deTuta absoluta. En forma paralela, con el propósito de acentuar la acción de la toxina,se incluyó una proteína con actividad quitinásica a fin de evaluar un eventual efectosinérgico. De las líneas transgénicas generadas, tanto aquellas líneas que soloexpresaban uno de los genes (cry1Ab o chit33) como aquellas otras líneas de plantasque solo expresaban el gen chit33 y que fueron asperjadas con un formulado de Bacillusthuringiensis (Bt), se logró un nivel de control de la polilla del tomate (Tuta absoluta)superior a las plantas sin transformar. Lo anterior se vio reflejado en un menor desarrollo larval y por consiguiente en un menor daño foliar. Además las plantas queexpresaban el gen chit33 fueron ensayadas bajo la presión del inóculo de un hongo,Botrytis cinerea, dando como resultado plantas que fueron capaces de sobrevivir a lainfestación por sobre los 15 días en comparación a las plantas sin transformar que sólo no resistieron más de 6 días, en comparación a las plantas sin transformar. Los resultados del presente trabajo sugieren que la expresión conjunta de un gen Bt y un genchit33 puede ser una opción biotecnológica para un control más efectivo de esta plaga./ SUMMARY:Currently there is concern about the indiscriminate use of pesticides inagriculture. In response to this situation, in recent years has stimulated the use of"biopesticides" considering that chemical pesticides are safe from the environmentalpoint of view and safe for other living beings. The greatest number of species known to bio-insecticides properties belonging to the genus Bacillus, in particular to the species Bacillus thuringiensis (Bt). Some Bt isolates, tested in laboratory conditions (Niedmann, 2003), presented interesting insecticidal activities against larvae of tomato moth (Tuta absoluta). However, the results were not entirely satisfactory, mainly due to food habits of this pest. The alternative used to address this problem was to generate transgenic plants capable of expressing a gene selected from one of the δ-endotoxins active against larvae of Tuta absoluta. In parallel with the purpose of emphasizing the action of Bt toxin, was added to test a protein with chitinase activity to evaluate a possible synergistic effect. Generated transgenic lines, both lines that only expressed one of the gen (cry1Ab o chit33) as any other plant lines expressed the gen only chit33, sprayed with a formulation of Bacillus thuringiensis (Bt), was achieved a level of control oftomato moth (Tuta absoluta) than unprocessed plants. This was reflected in lower leafdamage and therefore reduced larval development. In addition, plants expressing thechit33 gene were tested under the pressure of an inoculum of the fungus Botrytiscinerea, resulting in plants that were able to survive the infestation over 15 dayscompared to plants without transformation that resisted only 6 days. The results of thiswork suggest that the joint expression of a Bt gene and a chit33 gene might be abiotechnological option for an effective control of this pest.<br/><br/>Description: 123 p. http://dspace.utalca.cl/handle/1950/8567 Title: Análisis de la expresión diferencial de genes involucrados en las vías metabólicas responsables de la síntesis de antocianinas en frutos de Fragaria chilensis ssp. chiloensis f. chiloensis y Fragaria chiloensis ssp. chilensis f. patagónica<br/><br/>Authors: Salvatierra Castro, Ariel Rienso; Herrera Faúndez, Raúl (Prof. Guía); Caligari, Peter D.S. (Prof. Guía)<br/><br/>Abstract: El objetivo de la tesis doctoral fue realizar un estudio comparativo de la pigmentación defruto dentro de las dos formas botánicas de Fragaria chiloensis ssp. chiloensis. El estudio fue abordado a nivel transcripcional y químico. Para ello, frutos de ambas formas botánicas, f. chiloensis (frutilla nativa blanca) y f. patagonica (frutilla nativa roja), fueron recolectados en cuatro distintos estadios de desarrollo y maduración (verde pequeño, verde grande, blanco y maduro). A partir de fruto completo, sus órganos constituyentes (receptáculo yaquenio) y tejidos, se analizaron los perfiles transcripcionales de genes estructurales y regulatorios (factores de transcripción) involucrados en las vías de biosíntesis de compuestos fenilpropanoides responsables de la formación de antocianinas a lo largo de los diferentes estadios. Mediante este exhaustivo análisis transcripcional, se seleccionó uno delos genes regulatorios, FcMYB1, debido a su expresión diferencial detectada entrereceptáculo de fruto rojo y blanco. El ortólogo de este gen aislado en frutilla comercial demostró ser un supresor de la acumulación de pigmentos antociánicos en el sistema heterólogo de Nicotiana. Para caracterizar su función de manera homóloga en Fragaria chiloensis ssp. chiloensis f. chiloensis, frutos de frutilla blanca en estadio verde grande fueron agroinyectados con una cepa de A. tumefaciens portadora de una construcción de RNAi para FcMYB1 y cosechados en estadio maduro. Este trabajo demostró que la supresión génica del factor de transcripción FcMYB1 propició la aparición de un fenotipo de frutos más pigmentados que los frutos control agroinyectados con vector vacío. Consecuentemente, los genes flavonoides finales relacionados con la biosíntesis de proantocianidinas mostraron niveles muy bajos de transcritos de leucoantocianidina reductasa (LAR) y antocianidina reductasa (ANR) en contraste con los niveles aumentados de transcritos de genes directamente relacionados con la biosíntesis de pigmentos antociánicos, antocianidina sintasa (ANS) y UDP-glicosiltransfersa (UFGT). Estaredirección a nivel transcripcional de la vía flavonoides coincidió con una mayoracumulación de antocianinas en frutos agroinyectados con la construcción RNAi-FcMYB1 detectadas por HPLC-DAD.En conclusión, por medio del estudio comparativo en frutos contrastantes en pigmentación de una misma especie de frutilla, se detectaron diferencias en los niveles de transcritos de genes estructurales y regulatorios. Tras este análisis se seleccionó un factor de transcripción que demostró ser importante en la producción de pigmentos en esta especie.Los genes diferencialmente expresados (estructurales y/o regulatorios) identificados en esta investigación pueden ser empleados como marcadores moleculares para asistir los programas de mejoramiento genético de frutilla./ABSTRACT: The aim of this doctoral thesis was to perform a comparative study of the fruit pigmentationof two botanical forms of Fragaria chiloensis ssp. chiloensis. The study was carried out atthe transcriptional and chemical level. For this purpose, fruits of both botanical forms, f. chiloensis (white native strawberry) and f. patagonica (red native strawberry), werecollected and sorted in four distinct developmental and ripening stages (small green, large green, white and ripe). From whole fruit, their constituent organs (receptacle and achene) and tissues, the transcriptional profiles of structural and regulatory (transcription factors)genes involved in anthocyanin related biosynthesis pathways were assessed among thedifferent stages. By means of this exhaustive transcriptional analysis, FcMYB1, a regulatoty gene was selected due to its differential expression detected between the receptacle of red and white fruits. Its orthologous gene isolated from the commercial strawberry demonstrated it to be a suppressor of the anthocyanin pigment as shown by accumulation in the heterologous system Nicotiana. For characterizing its function in a homologue manner in Fragaria chiloensis ssp. chiloensis f. chiloensis, fruits of white strawberry at large green stage were agroinjected with an A. tumefaciens strain bearing a RNAi construct for FcMYB1 and collected at ripe stage. According to this work, the gene suppression of this FT FcMYB1 favored a more pigmented phenotype in these fruits than in control fruits agroinjected with empty vector. Consequently, the final flavonoid genes related with proanthocyanidin biosynthesis showed very low levels of leucoanthocyanidin reductase (LAR) and anthocyanidin reductase (ANR) in contrast to the elevated transcript levels ofgenes closely related to anthocyanic pigment biosynthesis, anthocyanidin synthase (ANS) yUDP-glycosyltransferse (UFGT). This flavonoid pathway redirection at the transcriptionallevel coincided with a greater accumulation of anthocyanin in RNAi-FcMYB1 agroinjectedfruits assessed by HPLC-DAD. In conclusion, through this comparative study carried out in fruits with contrasting pigmentation in the same strawberry species, differences in transcript levels of structural and regulatory genes were detected. After this analysis, a transcription factor that proved to be important in the pigment production in this specie was selected. Differentially expressed (structural and/or regulatory) genes identified in this researchcould be used as molecular markers for assisting strawberry breeding programs.<br/><br/>Description: 133 p. http://dspace.utalca.cl/handle/1950/8312 Title: Caracterizacion funcional de genes involucrados en el transporte de Zinc en vides y su relacion con el desarrollo de frutos en Vitis vinifera cv. Carmenere<br/><br/>Authors: Gainza Cortes, Felipe Ignacio; Gonzalez Villanueva, Enrique (Prof. Guia); Ruiz Lara, Simon (Prof. Guia)<br/><br/>Abstract: El zinc es uno de los microelementos fundamentales para el desarrollo normal delas especies vegetales. En vides la deficiencia de zinc se manifiesta fundamentalmente anivel de desarrollo reproductivo afectando la fructificación y el desarrollo normal defrutos, traduciéndose en la producción de racimos con bayas semilladas de tamaño normal y bayas sin semilla de pequeño tamaño. Debido a que el zinc no puede difundir pasivamente a través de las membranas celulares, éste debe ser transportado dentro de compartimentos intracelulares paratodos los procesos biológicos donde es requerido, otorgando especial relevancia a proteínas transportadoras involucradas en la captación y distribución de este metal. Importantes miembros de las familias génicas que codifican para los transportadores tipo ZIP (“Zinc‐regulated transporters, Iron‐regulated transproter‐like Protein”), tipo CDF (“Cation Diffuser Facilitator”) y tipo HMA (“Heavy Metal ATPase”), han sido identificados y caracterizados en varias especies de plantas. Sin embargo, a la fecha no han sido caracterizados los genes que codifican para tales transportadores en vides. El análisis de una librería de expresión construida a partir de bayas de Vitis vinifera Cv. Carménère , hapermitido identificar, aislar y caracterizar los ADNc que codifican para transportadoresputativos, denominados VvZIP3, VvMTP1 y VvHMA5.4. Las secuencias proteicas deducidas indican una fuerte homología con miembros de cada una de las respectivas familias de transportadores de Arabidopsis thaliana y otras especies vegetales. Por otra parte, el gen que codifica a VvZIP3 complementa el crecimiento defectuoso de lamutante de levadura ZHY3 (deficiente en la asimilación de zinc), en tanto que la proteínade fusión VvZIP3:GFP se localiza en la membrana plasmática, sugiriendo que esta proteínaactuaría como un transportador de captación de zinc. El análisis de los perfiles transcripcionales de los genes VvZIP3, VvMTP1 yVvHMA5.4 mostró que todos ellos están principalmente expresados en tejidoreproductivo. Específicamente, el gen VvZIP3 es principalmente expresado en flores, entanto que VvMTP1 en bayas inmaduras y VvHMA5.4 en tallos e inflorescencias. Además, VvZIP3 y VVMTP1 se encuentran reprimidos en frutos partenocárpicos no semillados, en tanto que VvHMA5.4 no registra diferencia en expresión entre frutos normales y frutos partenocárpicos. El perfil de expresión de VvZIP3 se correlaciona con los patrones de acumulación de zinc, detectándose un mayor contenido de este elemento en bayas normales al estadio de “pre‐envero” y un menor contenido en bayas partenocarpicas.Los resultados sugieren que los transportadores VvZIP3, VvMTP1 y VvHMA5.4 estarían asociados a la captación y distribución de zinc y otros metales durante el desarrollo reproductivo lo que puede significar que la disponibilidad de zinc tendríarelevancia para el desarrollo normal de las bayas en Vitis vinifera./ ABSTRACT: Zinc deficiency is one of the most widespread mineral nutritional problems that affect normal development in plants. Because Zn cannot passively diffuse across cell membranes, it must be transported into intracellular compartments for all biologicalprocesses where Zn is required. Several members of the Zinc‐regulated transporters, Ironregulatedtransporter‐like Protein (ZIP), Cation Diffuser Facilitator (CDF) and Heavy Metal ATPase’s (HMA) gene families have been characterized in plants, and have shown to be involved in metal uptake and transport. However, these transporters have not been characterized in grapevine. Unravel their function may explain important symptoms ofzinc deficiency in grapevines as abscission and parthenocarpy and the production ofclusters with seeded and unseeded berries.Have identified and characterized genes for putative metal transporters from an expression library of berries of Vitis vinifera Cv. Carménère, named VvZIP3, VvMTP1 and VvHMA5.4. Their predicted protein sequences show strong similarity with several members of each family of transporters from Arabidopsis thaliana and other plant species. Moreover, VvZIP3 gene complements the defective growth of a yeast Zn‐uptakemutant ZHY3, deficient in zinc‐uptake. The encoded protein is localized in the plasmamembrane, indicating that VvZIP3 corresponds to an uptake Zn transporter. VvZIP3, VvMTP1 and VvHMA5.4 are mainly expressed in reproductive tissue – VvZIP3 inVvZIP3 in developing flowers, VvMTP1 in immature berries and VvHMA5.4 in stems and little clusters. These expression profiles correlate with the zinc accumulation patterns in these organs. On the other hand, the low expression of VvZIP3 and VvMTP1 in parthenocarpicberries shows a straight relationship with the low level of Zn accumulation in this tissuewhen compared to normal seeded berries.The above results suggest that VvZIP3, VvMTP1 and VvHMA5.4 would be associated in zinc and metal uptake and distribution during the reproductivedevelopment which may mean that the availability of zinc would be relevant for normal berry development of Vitis vinifera.<br/><br/>Description: 150 p.