Estudio comparativo de la estructura de la proteína pectato liasa en las especies Fragaria chiloensis y Fragaria x ananassa, y su interacción con un sustrato modelo

Abstract

Alrededor de todo el mundo se cultiva la frutilla comercial Fragaria x ananassa. En Chile existe una especie de frutilla nativa llamada Fragaria chiloensis que presenta mejor sabor, aroma, y resistencia a patógenos, sin embargo posee una mayor tasa de ablandamiento con respecto a la frutilla comercial. Este ablandamiento ha sido atribuido a la modificación de la estructura de la pared celular, producto de la acción de un conjunto de enzimas hidrolíticas, entre las cuales destaca la proteína pectato liasa (PL), responsable del rompimiento de los enlaces α (1-4) del ácido poligalacturónico, presente en la pared celular vegetal. Para estudiar como la PL de estas dos especies de frutilla, degradan la pared celular vegetal, se ha construido a través del modelado por homología la estructura tridimensional de la PL de F. chiloensis (FcPL1) y F. x ananassa (FaPL1). Ambos modelos presentan un plegamiento del tipo hélice β-paralela, característico de la familia de las PL. . Además, por métodos de simulación del acoplamiento molecular entre los modelos y su sustrato (que presentaba iones Ca+2), se pudo identificar un conjunto de interacciones, en donde destacan tres residuos de argininas putativamente involucradas en la catálisis de ambas PLs (Arg-250, Arg-253 y Arg-255) y tres residuos de aspárticos, (Asp-172, Asp-194 y Asp-198 en FcPL1, y Asp-172, Asp- 198 en FaPL1), que son importantes en la coordinación del ión Ca+2, el cual actúa como cofactor para la pectato liasa. El estudio de la interacción de los residuos del sitio activo, con el sustrato, sugieren que la PL de frutilla, degradaría su sustrato a través del mecanismo de β- eliminación. Esta conclusión se basa en los resultados del análisis del complejo FcPL-ácido hexagalacturónico, en donde se encontró una molécula de agua a 1,6 Å neutralizando el ácido carboxílico de un monómero del ácido hexagalacturónico, pudiendo realizar el primer paso del mecanismo de β-eliminación. Para el segundo paso, se encontró a la Arg-255 a 3.7 Å del C5 del mismo monómero, pudiendo actuar como base para la abstracción del protón de ese carbono. Y Arg-253 a 6.0 Å del oxígeno del enlace glicosídico α-(1-4), entre dos monómeros del sustrato), que actuaría como ácido, protonando ese oxígeno para permitir el rompimiento del enlace glucosídico del ácido hexa-galacturónico. El estudio de la interacción de FcPL1 con el sustrato con iones Ca+2 reveló la interacción con 12 residuos del modelo, en contraste a la interacción con el sustrato sin iones Ca+2, donde se vieron involucrados solamente 11 residuos. La cantidad y diferencias en los residuos que interactúan con los sustratos, sugiere que existe una mejor estabilización de interacción, con el sustrato con iones calcio./ ABSTRACT: Around the world is cultivated the commercial strawberry "Fragaria x ananassa '. In Chile there is a native variety called "Fragaria chiloensis" that was best flavor, smell and resistance to pathogens, but has a higher rate of softening with respect to the commercial strawberry. This debilitation has been attributed to changes in the cell wall structure resulting from the action of a set of hydrolytic enzymes, among which the protein pectate lyase (PL), responsible for the breaking of the bonds α (1-4) of polygalacturonic acid, present in the plant cell wall. To study how the PL of these two varieties of strawberry, degrade the plant cell wall has been built through homology modeling with multiple templated, the 3D structure of the PL of F. chiloensis (FcPL1) and F. x ananassa (FaPL1). Both models have a structure β-parallel like family of PL. The study of PL sequences of both strawberries, reveals three conserved motifs: WIDH, DGLIDAIMGSTAITISNNYF and LIQRM PRCRHGYFHVVNNDY. Furthermore, for simulation methods of coupling between models and its substrate (which had Ca+2), showed a network interactions, which include three arginine residues putatively involved in the catalysis of both PLs (Arg-250, Arg-253 and Arg- 255), and the aspartic residues (Asp-172, Asp-194 and Asp-198 in FcPL1, and Asp-172 and Asp-198 in FaPL1), which are important in the coordination of Ca+2 ion, which acts as a cofactor for pectate lyase. The study of the interaction of the active site residues, with the substrate, suggesting that PL strawberry degrade the substrate through β-elimination echanism. This conclusion is based on the analysis results hexagalacturónico acid FCPL complex, where was found a water molecule to 1.6 to neutralize the arboxylic acid monomer hexagalacturónico acid, may perform the first step of the mechanism of β-elimination. For the second step, was found to Arg-255 at 3.7 Å from C5 of the same monomer, and can act as a base for proton abstraction of that carbon. Arg-253 and 6.0 Å from the oxygen to the glycosidic bond α-(1-4), between two monomers of the substrate), which act as acid, protonating the oxygen to allow the glycosidic bond breakage hexa-galacturonic acid.