Caracterización de un factor de transcripción de la familia NAC y su rol en el proceso de ablandamiento en frutos de Fragaria chiloensis L. (Duch.)

Abstract

Fragaria chiloensis es una rosacea endémica de chile, la cual genera un fruto con particulares características como atractivo sabor, agradable aroma, alta tasa fotosintética, resistencia a enfermedades, el cual ha sido propuesto como recurso agronómico de exportación dado el interés económico que este genera. Sin embargo, este fruto presenta un periodo de post-cosecha muy limitado y su ablandamiento es muy rápido. Este hecho, ha generado un desplazamiento del fruto de F. chiloensis por otros cultivares como Frutilla comercial (F. x ananassa) provenientes de Norte América, el cual presenta un ablandamiento menos acelerado. Como el mercado nacional e internacional ha aumentado la demanda de frutos más llamativos y exóticos, F. chiloensis se ha convertido en una nueva alternativa de exportación para nuestro país y ha emergido como una especie de estudio de eventos asociados a la maduración y ablandamiento de frutos. La madurez de un fruto se circunscribe en la sinérgia de procesos tanto fisiológicos como bioquímicos dados en etapas de su desarrollo. La maduración de los frutos de especies de Fragaria, los cuales son clasificados como frutos no climatéricos, son regulados por la participación de diversos factores moleculares, entre ellos factores de transcripción, los cuales son familias de proteínas que coordinan y regulan la expresión de un gen o de un grupo de genes, y en muchos casos, regulan su propia expresión. Los factores de transcripción de la familia NAC (NAM, ATAF1,2 y CUC2) son específicos de plantas y realizan distintas funciones promoviendo la regulación transcriptional de diversos tipos de genes, entre ellos, algunos descritos que presentan relación directa con modificaciones fisiológicas y cambios en la pared celular que ocurren durante la maduración de los fruto, tales como Poligalacturonasas, Pectatoliasas, Endoglucanasas, Expansinas, Xiloglucano Endotransglicosilasas/hidrolasas, entre otros, los cuales presentan en sus zonas promotoras elementos en cis que son reconocidos por factores de transcripción de la familia NAC. El rol de los factores de transcripción de la familia NAC en el proceso de maduración y ablandamiendo en frutilla chilena, es a la fecha, desconocido y surge la necesidad de realizar estudios para poder entender este proceso. Por esta razón, el objetivo de esta tesis doctoral fue identificar, clonar y caracterizar un factor de transcripción de la familia NAC (FcNAC1) de F. chiloensis, el cual presentó un cDNA compuesto por 999 bp que codifica una proteína de 332 aminoácidos y que presenta en su zona amino terminal el dominio conservado de la familia NAC. Se realizaron análisis filogenéticos con miembros de esta familia con función conocida y fue posible apreciar que FcNAC1 presenta cercanía evolutiva con SND2 (SECONDARY WALL-ASSOCIATED NAC DOMAIN PROTEIN 2), el cual está involucrado en la remodelación de la pared celular. Mediante transformación transciente de hojas de tabaco por agroinfiltración, fue posible determinar la localización sub-celular de nuestro factor de transcripción evidenciado que este se encuentra en el núcleo. También se determinó la variación en la expresión de FcNAC1 durante el desarrollo y maduración del fruto, donde fue posible determinar que los niveles de transcritos aumentan concomitante al proceso de maduración y desarrollo del fruto, además fue posible apreciar que el perfil transcripcional en tejidos vegetativos presentó una mayor acumulación de estos en flores, paso previo a la formación del fruto, no así en otros tejidos como raíces, estolones, hojas y tallos. Mediante la técnica Genome-walker, fue posible obtener un fragmento de 1488 pb concerniente al promotor del gen FcNAC1 y mediante análisis in-sílico se pudo evidenciar putativos elementos en cis de respuesta a señales hormonales, como también sitios de reconocimiento para factores de transcripción de la familia NAC denominados SNBEs (Secondary wall NAC binding elements). Con el objetivo de entender sobre la regulación transcripción a nivel hormonal de FcNAC1, se realizaron ensayos de tratamientos hormonales en frutos, donde se pudo apreciar que existe un efecto de regulación positiva por ácido abscísico y una regulación negativa por parte de auxinas (IAA) en el experimento realizado. Para poder indagar sobre la conformación estructural del factor de transcripción FcNAC1 y haciendo uso de herramientas bioinformáticas, fue posible obtener la estructura tridimensional de la proteína, su conformación como homodímero, su interacción en el reconocimiento del DNA y se describe aquellos residuos importantes que permiten la estabilización de esta interacción. Como se desconocía la función que podría estar realizando este factor de transcripción, se realizó una transactivación transcripcional mediante un ensayo de luciferasa dual, donde fue posible apreciar que FcNAC1 presenta actividad transcripcional contra la secuencia promotora de un gen relacionado a la remodelación de la pared celular, lo que permite inferir que FcNAC1 estaría involucrado en el proceso de remodelación de pared celular, evento concomitante con el ablandamiento de los frutos de F. chiloensis. Ademas, fue posible identificar otro miembro de esta familia, denominamdo FcNAC2, compuesto de un cDNA de 1038 bp que codifica una proteína de 346 aminoácidos y que tambien presenta el dominio conservado de la familia NAC en su zona amino terminal. Al realizar análisis filogenéticos fue posible apreciar que FcNAC2 presenta cercanía evolutiva con AtNAC2 (NAC-REGULATED SEED MOPHOLOGY 1, NARS1), del cual se describe que podría estar involucrado en la incorporación de estimulos medioambientales y endógenos en el proceso de desarrollo de raíces laterales. Se evaluaó la expresión relativa de FcNAC2 en fruto y en tejidos vegetativos, donde fue posible apreciar que los niveles de transcritos aumentan conforme avanza el proceso de desarrollo y maduración del fruto y presentó un alto nivel de transcritos en raíces, tallos y estolones. Finalmente, ensayos de luciferasa dual nos sugieren que FcNAC1 y FcNAC2 podrían estar interactuando conjuntamente promoviendo la expresión de genes relacionados a la remodelación de la pared celular./ABSTRACT:of environmental and endogenous stimuli in the lateral root development process. The relative expression of FcNAC2 in fruit and in vegetative tissues was evaluated, where it was possible to appreciate that transcript levels increase as the fruit development and maturation process progresses and presenting a high transcripts level in roots, stems and stolons. Finally, dual luciferase assays suggest that FcNAC1 and FcNAC2 could be interacting together promoting the expression of genes related to cell wall remodeling. Fragaria chiloensis is a one endemic rosacea from Chile, which produces a fruit with interesting characteristics such as an attractive taste, pleasant aroma, disease resistance. This specie has been proposed as an agronomic resource for exportation, together with the economic interest which generates. However, this fruit show a limited post-harvest period and a fast softening process. This fact has generated a displacement of the F. chiloensis fruit by other cultivars such as the commercial strawberry (F. x ananassa) from North America, which presents more firmess after ripening. As the national and international market has increased its demand for more attractive and exotic fruits, F. chiloensis has become a new alternative for export our country and has emerged as a model for studies associated to ripening and softening of fruits. The fruit maturity is circumscribed in a synergic process such physiological and biochemical at development stages. The fruit madurity in Fragaria species, which are non-climacteric fruits, are regulated by the participation of various molecular factors, including transcription factors, which are family proteins that coordinate and regulate the expression of a gene or group of genes, and in many cases, regulate their own expression. The transcription factors of the NAC family (NAM, ATAF1,2 and CUC2) are plant-specific and perform different functions promoting the transcriptional regulation of various types of genes, including some described that are directly related to physiological modifications and changes in cell walls. This changes occur during fruit maturation and alter enzymes such as, Polygalacturonases, Pectatolyases, Endoglucanases, Expansines, Xyloglucan Endotransglycosilases/hydrolases, among others, which have in their promoter zones cis elements that are recognized by transcription factors of the NAC family. The role in the maturation and softening process of NAC transcription factors family in Chilean strawberry is, to date, unknown. This fact arises the need to carry out more studies in order to understand this process. For this reason, the objective of this doctoral thesis was to identify, clone and characterize a NAC from F. chiloensis (FcNAC1), which presented a cDNA sequence of 999 bp, that encodes a protein of 332 amino acids and present the conserved domain of the NAC family in its amino terminal. Phylogenetic analyzes were performed with members of this family with known function and it was possible to appreciate that FcNAC1 presents an evolutionary closeness with SND2 (SECONDARY WALL-ASSOCIATED NAC DOMAIN PROTEIN 2), which is involved in cell wall remodeling. Through trans-transformation of tobacco leaves by agroinfiltration, it was possible to determine the subcellular location of our transcription factor evidenced that is found in the nucleus. The variation in FcNAC1 expression during fruit development and maturation was also determined, where it was possible to see that the transcript levels increase concomitant to the maturation and fruit development process, in addition it was possible to appreciate that the transcriptional profile in vegetative tissues presented a greater accumulation of these in flowers, previous to the fruit formation step, albeit, not accumulation of transcript was observed in other tissues as roots, stolons, leaves and stems. Using Genome-walker technique, it was possible to obtain a 1488 bp fragment concerning to FcNAC1 promoter sequence and through in-silico analysis it was possible to evidence putative cis elements in response to hormonal signals and also the recognition sites for the NAC family called SNBEs (Secondary wall NAC binding elements). In order to understand the hormonal transcription regulation of FcNAC1, hormonal treatments in fruits were carried out, where it was possible to see that there is a positive regulator effect by abscisic acid and a negative regulation by auxins (IAA). In order to investigate the structural conformation of FcNAC1 and making use of bioinformatic tools, the three-dimensional protein structure was obtained, its homodimer conformation, its DNA recognition interaction and important residues that allow the stabilization of this interaction is described. A transcriptional transactivation was performed by dual luciferase assay, where it was possible to appreciate that FcNAC1 has transcriptional activity against a promoter sequence of a gene related to cell wall remodeling, which allows us to suggest that FcNAC1 would be involved in the cell wall remodeling process, concomitant event with the fall of firmness of F. chiloensis fruits. In addition, another member of this family which we named FcNAC2 was identified, composed of 1038 bp cDNA that encodes a protein of 346 amino acids and also presenting the conserved NAC domain in its amino terminal zone. When phylogenetic analyzes was performed, it was possible to see that FcNAC2 presents evolutionary closeness with AtNAC2 (NAC-REGULATED SEED MOPHOLOGY 1, NARS1), which describes that it could be involved in the incorporation of of environmental and endogenous stimuli in the lateral root development process. The relative expression of FcNAC2 in fruit and in vegetative tissues was evaluated, where it was possible to appreciate that transcript levels increase as the fruit development and maturation process progresses and presenting a high transcripts level in roots, stems and stolons. Finally, dual luciferase assays suggest that FcNAC1 and FcNAC2 could be interacting together promoting the expression of genes related to cell wall remodeling.