Estandarización de PCR para la detección de la mutación del gen HTT en la enfermedad de Huntington

Abstract

La enfermedad de Huntington (EH) es una enfermedad neurodegenerativa con herencia autosómica dominante que afecta el sistema nervioso central y más predominantemente a los núcleos basales, caracterizada por movimientos involuntarios tipo corea, alteraciones psiquiátricas y deterioro cognitivo. Se origina por una mutación tipo expansión del trinucleótido CAG del extremo 5’, en el exón 1 del gen que codifica la proteína Huntingtina (HTT), localizado en el brazo corto del cromosoma 4 (4p16.3). Actualmente en Chile la prueba diagnóstica suele ser poco accesible debido a su alto costo. Es por ello entonces, que el objetivo de este estudio fue estandarizar un protocolo de PCR para la detección de la mutación del gen HTT en la enfermedad de Huntington, mucho más económico, y acorde a la realidad de los centros de salud del país. Las variables implicadas en la estandarización fueron: concentración de cloruro de magnesio (MgCl2), porcentaje del aditivo para la Taq polimerasa, concentración de ADN, número de ciclos de la PCR y cambio de la temperatura de alineamiento de iniciadores. Estas fueron aplicadas a una muestra de paciente sano (sin la mutación) y a una muestra de paciente que presentaba signos de la enfermedad (con la mutación), ambos con resultado de prueba genética conocido y confirmado por PCR y electroforesis capilar en laboratorio externo. Se encontró que las condiciones óptimas tanto para la mezcla de reacción de PCR, como para el programa de amplificación fueron: concentración de 2mM de cloruro de magnesio (MgCl2), 100 ng/uL de ADN, 10% de aditivo, temperatura de anillado de iniciadores de 65°C y 30 ciclos en la reacción, verificado en un gel de agarosa al 2%. Por lo tanto, se estandarizaron los parámetros de la reacción de PCR convencional que permitirían la detección de la mutación del gen HTT en la enfermedad de Huntington para su respectiva validación y caracterización específica en geles de poliacrilamida.