Evaluacion de protocolos de IC-RT-PCR en la determinacion de Grapevine leafroll associated virus-3 (GLRaV-3) en tejido de vid

Abstract

Grapevine leafroll associated virus (GLRaV) es considerada una de las enfermedades con mayor importancia a nivel mundial, ya que produce diversas sintomatologías en plantas que van desde la disminución de la productividad hasta la muerte del hospedero. Debido a que el control de esta enfermedad es principalmente preventivo, se evaluó la implementación de dos protocolos de Transcripción reversa - Reacción en cadena de la polimerasa asociado a Inmunocaptura, (IC-PCR) para la detección de GLRaV-3 para un diagnóstico más simple y asertivo de la enfermedad sin necesidad de purificar el virus y extraer el RNA previamente. Se muestrearon 8 viñedos de la VII región en los que se colectaron 387 muestras con sintomatología posible de asociar a enfermedades de naturaleza viral, las que se analizaron mediante serología (DAS-ELISA) en una primera etapa para definir aquellas que presentaban el patógeno. Luego las muestras positivas fueron analizadas por diferentes protocolos de IC-RT-PCR sin resultados favorables probablemente debido a diversos factores como distribución des-uniforme del virus en el tejido leñoso, época de muestreo, o falta de puesta a punto de algunos pasos dentro de los protocolos evaluados. Este resultado deja de manifiesto que factores como la presencia de sustancias contaminantes que estarían presentes en los tejidos vegetales al momento de la extracción de los ácidos ribonucleicos (ARN) como polisacáridos y compuestos fenólicos, tienen un efecto directo sobre la viabilidad del ARN y la acción de la enzima ADN polimerasa (Taq) durante la realización de la PCR. Teniendo además en cuenta la distribución irregular y la baja concentración del virus en las muestras de tejido de vid es posible explicar los resultados negativos de los ensayos. En vista de lo anterior es imprescindible tener en cuenta al momento de reformular los protocolos evaluados, los aspectos ya mencionados para una correcta realización de la técnica molecular IC-RT-PCR, al igual que considerar el utilizar tejido verde obtenido en una época de muestreo diferente.