Determinación del efecto y selectividad de cationes monovalentes en la inhibición alostérica de fosfofructoquinasa-2 de E. coli mediante dinámica molecular y cálculos de energía libre

Abstract

La familia riboquinasa incluye quinasas de azúcares y de nucleótidos dependientes de ATP que usan metales divalentes como activadores catalíticos. Adicionalmente, se ha propuesto un sitio conservado para la unión de cationes monovalentes. En algunos miembros de la familia, como riboquinasa y adenosina quinasa, la presencia de K+ activa la enzima incrementando la afinidad por el aceptor del fosfato y el valor de sus constantes catalíticas. Estos cambios se correlacionan con movimientos de residuos en el sitio activo observados en estructuras obtenidas en presencia de metales monovalentes. Sin embargo, se desconoce el mecanismo molecular de la “activación” enzimática mediada por cationes monovalentes y las bases estructurales de la “selectividad” por dichos cationes. La fosfofructoquinasa-2 (Pfk-2) presenta un sitio alostérico para MgATP que regula negativamente su actividad. Estudios bioquímicos muestran que la unión de K+ (pero no Na+) favorece la inhibición alostérica de Pfk-2 aumentando la afinidad por MgATP, sin variar la constante catalítica y la afinidad de sus sustratos. En acuerdo con estos antecedentes, las estructuras cristalográficas de Pfk-2, obtenidas en presencia de Cs+ y K+ , muestran el sitio conservado para metales monovalentes de la familia riboquinasa próximo al sitio alostérico de MgATP, donde la presencia de estos metales no induce grandes cambios conformacionales en comparación con la estructura carente de ellos. Para estudiar la selectividad del sitio para cationes monovalentes de Pfk-2, se calculó la diferencia de energía libre de Gibbs (ΔΔG) entre K+ y Na+, utilizando el método FEP (Free energy perturbation). Luego, mediante simulaciones de dinámica molecular se estudió el efecto de distintos cationes monovalentes (Na+, K+, Cs+) en la conformación estructural de Pfk-2. Por último, se evaluó la energía libre de unión de MgATP en el sitio alostérico de Pfk-2 en presencia y ausencia de K+, utilizando el método MM/PBSA (Molecular Mechanics/Poisson Boltzmann Surface Area). El sitio para cationes monovalentes mostró una preferencia de aproximadamente 3 kcal/mol en favor de K+. Por otro lado, Lys27, Arg29 y Arg105, son importantes en la unión y estabilidad de MgATP en el sitio alostérico de Pfk-2. Los resultados obtenidos con técnicas de mecánica molecular coinciden con lo observado experimentalmente./ABSTRACT: The ribokinase family of enzymes includes a variety of ATP-dependent sugar and nucleotide kinases that use divalent metals as catalytic activators. Additionally, the presence of a conserved site for monovalent cations has been proposed. In ribokinase and adenosine kinase, K+ activates the enzymes by increasing the affinity for the phosphate acceptor and the value of their catalytic constants. These changes are correlated with the movement of residues in the active site of structures obtained in presence of monovalent metals. However, the molecular mechanism behind the enzymatic activation mediated by monovalent cations and the structural basis governing the selectivity of these cations, are unknown. Phosphofructokinase-2 (Pfk-2), presents an allosteric site for MgATP that negatively regulates its enzymatic activity. Biochemical studies show that K+ (but not Na+) enhances the allosteric inhibition by increasing the affinity of MgATP, without alteration of the catalytic constants and its substrates affinities. In agreement with these precedents, the threedimensional estructure of Pfk-2 in the presence of K+ or Cs+ shows a cation binding site. This site is on a conserved position predicted for the ribokinase family adjacent to the MgATP allosteric binding site, where the presence of these metals does not induce large conformational changes compared with the structure obtained in their absence. To study the selectivity of the monovalent cation binding site of Pfk-2, the Gibbs free energy difference (ΔΔG) between K+ and Na+ was calculated using a free energy perturbation method (FEP). Then, the effect of several monovalent cations (Na+, K+, Cs+) in the structural conformation of Pfk-2 was studied by means of molecular dynamics simulations. Finally, the binding free energy of MgATP on the allosteric binding site of Pfk-2 was evaluated in the presence and absence of K+ using the molecular mechanics/Poisson-Boltzmann Surface Area method (MM/PBSA) The monovalent cation binding site showed a preference of approximately 3 kcal/mol favoring K+. On the other hand, Lys27, Arg29 and Arg105 are important for the stability and binding of MgATP on the allosteric binding site of Pfk-2. The results obtained by molecular dynamics are in good agreement with the results obtained experimentally.